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Projeto de novo de biossensores de proteínas modulares e sintonizáveis

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Sep 06, 2023

Projeto de novo de biossensores de proteínas modulares e sintonizáveis

Natureza volume 591, páginas

Nature volume 591, páginas 482–487 (2021) Cite este artigo

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Interruptores de proteínas de ocorrência natural foram reaproveitados para o desenvolvimento de biossensores e repórteres para aplicações celulares e clínicas1. No entanto, o número de tais switches é limitado e sua reengenharia é um desafio. Aqui, mostramos que uma classe geral de biossensores baseados em proteínas pode ser criada invertendo o fluxo de informações por meio de interruptores de proteína projetados de novo, nos quais a ligação de uma chave peptídica aciona saídas biológicas de interesse2. Os sensores projetados são dispositivos moleculares modulares com um estado escuro fechado e um estado luminescente aberto; a ligação do analito conduz a mudança do estado fechado para o estado aberto. Como o sensor é baseado no acoplamento termodinâmico da ligação do analito à ativação do sensor, apenas um domínio de ligação alvo é necessário, o que simplifica o projeto do sensor e permite a leitura direta na solução. Criamos biossensores que podem detectar com sensibilidade a proteína anti-apoptose BCL-2, o domínio IgG1 Fc, o receptor HER2 e a neurotoxina botulínica B, além de biossensores para troponina I cardíaca e um anticorpo anti-vírus da hepatite B com alta sensibilidade necessários para detectar essas moléculas clinicamente. Dada a necessidade de ferramentas de diagnóstico para rastrear o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)3, usamos a abordagem para projetar sensores para a proteína spike SARS-CoV-2 e anticorpos contra as proteínas de membrana e nucleocapsídeo. O primeiro, que incorpora um ligante de domínio de ligação ao receptor (RBD) projetado de novo4, tem um limite de detecção de 15 pM e um sinal de luminescência 50 vezes maior que o nível de fundo. A modularidade e a sensibilidade da plataforma devem permitir a construção rápida de sensores para uma ampla gama de analitos e destacam o poder do design de proteínas de novo para criar sistemas de proteínas multiestado com funções novas e úteis.

Os biossensores baseados em proteínas têm papéis importantes na biologia sintética e em aplicações clínicas, mas o projeto de biossensores até agora tem sido limitado principalmente à reengenharia de proteínas naturais1. Encontrar domínios específicos de ligação ao analito que sofrem alterações conformacionais após a ligação é um desafio e, mesmo quando disponível, geralmente são necessários esforços extensivos de engenharia de proteínas para acoplá-los efetivamente a um domínio repórter5,6. Portanto, é desejável construir plataformas de biossensores modulares que possam ser facilmente reaproveitadas para detectar diferentes alvos de proteínas de interesse. Sistemas modulares foram desenvolvidos para detectar anticorpos7,8,9 e pequenas moléculas10,11, mas os sensores gerais de proteínas são um desafio maior, dada a grande diversidade de estruturas de proteínas, tamanhos e estados de oligomerização e abordagens como plataformas de proteínas semissintéticas12,13,14 , ou interruptores de calmodulina15,16, geralmente requerem uma triagem considerável para encontrar candidatos potenciais devido à previsibilidade limitada17.

Um biossensor de proteína pode ser construído a partir de um sistema com dois estados quase isoenergéticos, cujo equilíbrio é modulado pelo analito que está sendo detectado. As propriedades desejáveis ​​em tal sensor são: (i) a mudança conformacional desencadeada por um analito deve ser independente dos detalhes do analito, então o mesmo sistema geral pode ser usado para detectar muitos alvos diferentes; (ii) o sistema deve ser sintonizável para que analitos com diferentes energias de ligação e diferentes concentrações típicas possam ser detectados em uma ampla faixa dinâmica; e (iii) a mudança conformacional deve ser acoplada a uma saída sensível. Nossa hipótese é que esses atributos poderiam ser obtidos invertendo o fluxo de informações em interruptores de proteína projetados de novo, nos quais a ligação a uma proteína alvo de interesse é controlada pela presença de um atuador de peptídeo2. Desenvolvemos um sistema que consistia em dois componentes de proteína: primeiro, um 'lucCage' que compreende um domínio de gaiola e um domínio de trava que contém um motivo de ligação ao alvo e um fragmento de luciferase dividido (pequeno BiT (SmBiT) 114)18; e segundo, um 'lucKey' que contém um peptídeo chave que se liga ao estado aberto de lucCage e ao fragmento complementar da luciferase dividida (large BiT (LgBit) 11S)18 (Fig. 1a). lucCage tem dois estados: um estado fechado, no qual o domínio da gaiola se liga à trava e oclui estericamente o motivo de ligação de se ligar ao alvo e SmBiT de se combinar com LgBit para reconstituir a atividade da luciferase, e um estado aberto, em que essas interações de ligação são não bloqueado e lucKey pode se ligar ao domínio da gaiola. A associação de lucKey com lucCage resulta na reconstituição da atividade da luciferase (Fig. 1a, direita). A termodinâmica do sistema é ajustada de forma que a energia livre de ligação de lucKey para lucCage (ΔGCK) seja insuficiente para superar o custo de energia livre de abertura de lucCage (ΔGopen) na ausência de alvo (ΔGopen − ΔGCK >> 0), mas em na presença do alvo, a energia livre de ligação adicional da trava ao alvo (ΔGLT) impulsiona a abertura da trava e a reconstituição da luciferase (ΔGopen − ΔGCK − ΔGLT << 0) (Fig. 1b, c). Este sistema satisfaz as propriedades (i) e (ii) acima, pois uma ampla gama de atividades de ligação pode ser enjaulada e, como o interruptor é controlado termodinamicamente, o lucKey e as energias de ligação alvo podem ser ajustados para atingir a ativação nas concentrações alvo relevantes. Como lucKey e lucCage são sempre os mesmos, o sistema é modular – a mesma associação molecular pode ser acoplada à ligação de muitos alvos diferentes. A bioluminescência fornece uma leitura rápida e sensível da associação lucCage-lucKey orientada pelo analito, satisfazendo a propriedade (iii).

15 ng ml−1; within the detection range of lucCageHER2) associated with metastatic breast cancer26./p>18 years) of both genders provided by the Director of the Clinical Chemistry Division, the hospital of University Washington. All anonymized donor specimens were provided de-identified. Because the donors consented to have their excess specimens be used for other experimental studies, they could be transferred to our study without additional consent. All samples were passed through 0.22-μm filters before use. Ten microlitres of 10× serial diluted monomeric RBD (167–0.69 nM), 5 μl of 20× lucCage (20 nM), 5 μl of 20× lucKey (20 nM), 5 μl of 20× Antares2 (2 nM), and 10, 20, 25 or 50 μl of human donor serum or simulated nasal matrix were mixed with 1:1 HBS:Nano-Glo assay buffer to reach a total volume of 75 μl. The plate was centrifuged at 1,000g for 1 min. Then, 25 μl of 25× diluted furimazine in buffer was added to each well. Bioluminescence signals were recorded from both 470/40 nm and 590/35 nm channels every 1 min for a total of 1 h. The ratio at each time point was calculated by the equation described in Extended Data Fig. 11b. Monomeric SARS-CoV-2 RBD was expressed and purified as previously described46./p>> I590). R470 is R590 × f, a predetermined constant for Antares2, and therefore the unmixed ratio (I470/R590) could be calculated in real time during signal acquisition. The constant f for Antares2 was consistently determined to be 0.43 by either recording the full spectra or from the filter set. c, Varying concentrations of RBD were spiked in 50%, 25% or 10% pooled serum or in 20% simulated nasal fluid. Absolute bioluminescence intensities and emission kinetics were different across the matrices owing to matrix inhibition effect and substrate turnover53. By contrast, calibration with Antares2 resulted in stable ratiometric signals (I470/R590). d, The bioluminescence intensity of lucCageRBD at saturating RBD concentration (green curve) is approximately 20-fold higher than the background level. Reporting the raw ratio (T470/T590) as a function of the RBD concentration compromises the sensor dynamic range (black curve) owing to a notable emission at the 470/40 nm channel (R470) from Antares2. After calculation and conversion of the unmixed ratio, the dynamic range becomes 20-fold higher than the background level with ratiometric readouts (magenta curve). e, Detection of spiked RBD in four different anonymized human sera (50%) shows that calibration using spectrally resolved Antares2 as an internal reference can minimize the variations of the intensiometric bioluminescence in these matrices. Bioluminescent signals and s.d. were measured in triplicate, and a representative one is shown for emission spectra and emission kinetics, respectively. Data are mean ± s.d./p>